Àìdọ́gba àwọn okùn iṣan egungun ènìyàn ju ẹ̀wọ̀n ìwúwo myosin lọ

Ẹ ṣeun fún ṣíbẹ̀wò sí nature.com. Ẹ̀yà ẹ̀rọ ìṣàwárí tí ẹ ń lò ní àtìlẹ́yìn CSS díẹ̀. Fún ìrírí tí ó dára jùlọ, a gbà yín nímọ̀ràn láti lo ẹ̀yà ẹ̀rọ ìṣàwárí tuntun (tàbí láti mú kí ipò ìbáramu ṣiṣẹ́ nínú Internet Explorer). Ní ​​àfikún, láti rí i dájú pé àtìlẹ́yìn ń bá a lọ, ojú òpó yìí kò ní sí àwọn àṣà àti JavaScript.
Iṣan egungun jẹ́ àsopọ onírúru tí ó ní myofibrils nínú, èyí tí a sábà máa ń pín sí oríṣi mẹ́ta nínú ènìyàn: ọ̀kan “lọ́ra” (irú 1) àti méjì “yára” (irú 2A àti 2X). Síbẹ̀síbẹ̀, ìyàtọ̀ láàárín àti láàárín àwọn oríṣi myofibril ìbílẹ̀ kò tíì yé wa dáadáa. A lo àwọn ọ̀nà transcriptomic àti proteomic sí àwọn myofibrils 1050 àti 1038 láti inú vastus lateralis ènìyàn, lẹ́sẹẹsẹ. Ìwádìí proteomic náà ní àwọn ọkùnrin nínú, ìwádìí transcriptomic náà sì ní àwọn ọkùnrin 10 àti obìnrin 2 nínú. Ní àfikún sí àwọn isoforms heavy chain myosin, a ṣàfihàn àwọn protein metabolic, àwọn protein ribosomal, àti àwọn protein junctional cellular gẹ́gẹ́ bí orísun onírúurú intermyofibril. Jù bẹ́ẹ̀ lọ, láìka ìdámọ̀ àwọn ìṣùpọ̀ àwọn okun onírọrùn àti kíákíá sí, àwọn ìwádìí wa fihàn pé àwọn okun onírú 2X kò ṣeé yà sọ́tọ̀ kúrò nínú àwọn okun onírọrùn mìíràn. Síwájú sí i, ìpínsọrí ẹ̀wọ̀n tó dá lórí myosin kò tó láti ṣàlàyé ìrísí myofiber nínú àwọn myopathies nemaline. Ní gbogbogbòò, àwọn ìwádìí wa dámọ̀ràn àìdọ́gba myofiber onípele púpọ̀, pẹ̀lú àwọn orísun ìyàtọ̀ tó ré kọjá àwọn isoforms ẹ̀wọ̀n tó wúwo myosin.
Àìdọ́gba sẹ́ẹ̀lì jẹ́ àmì àdánidá gbogbo ètò ẹ̀dá alààyè, èyí tí ó ń jẹ́ kí àwọn sẹ́ẹ̀lì ṣe pàtàkì láti bá àwọn àìní onírúurú ti àsopọ àti sẹ́ẹ̀lì mu.1 Ìwòye àtọwọ́dọ́wọ́ ti ìṣọ̀kan okùn iṣan egungun ni pé àwọn neuron motor ń ṣe àpèjúwe irú okùn nínú ẹ̀rọ motor kan, àti pé irú okùn (ìyẹn, irú 1, irú 2A, àti irú 2X nínú ènìyàn) ni a ń pinnu nípa àwọn ànímọ́ ti isoforms myosin heavy chain (MYH).2 Èyí ni a kọ́kọ́ dá lórí àìdúróṣinṣin pH ATPase wọn, 3,4 àti lẹ́yìn náà lórí ìfihàn molikula wọn ti MYH.5 Ṣùgbọ́n, pẹ̀lú ìdámọ̀ àti gbígbà lẹ́yìn náà ti àwọn okùn “adalu” tí wọ́n ń ṣe àfihàn ọ̀pọ̀lọpọ̀ MYH ní onírúurú ìwọ̀n, a ń wo àwọn okùn iṣan egungun bí ìtẹ̀síwájú dípò àwọn okùn okun pàtó.6 Láìka èyí sí, pápá náà ṣì gbẹ́kẹ̀lé MYH gidigidi gẹ́gẹ́ bí ìpínsípàtà àkọ́kọ́ fún ìpínsípàtà myofiber, èrò tí ó ṣeéṣe kí ó ní ipa lórí àwọn ìdíwọ̀n àti àwọn ìfàsẹ́yìn pàtàkì ti àwọn ìkẹ́kọ̀ọ́ eku ìṣáájú tí ìrísí ìfarahàn MYH àti oríṣiríṣi okùn okun yàtọ̀ sí àwọn ti ènìyàn.2 Ipò náà túbọ̀ díjú síi nípa òtítọ́ pé àwọn okùn egungun ènìyàn onírúurú ń ṣe àfihàn oríṣiríṣi okùn okun.7 Àṣàn vastus lateralis jẹ́ àdàpọ̀ iṣan pẹ̀lú ìrísí ìfarahàn MYH láàárín (àti nítorí náà ó dúró fún).7 Jù bẹ́ẹ̀ lọ, ìrọ̀rùn rẹ̀ láti ṣe àyẹ̀wò mú kí ó jẹ́ iṣan tí a ti kẹ́kọ̀ọ́ jùlọ nínú ènìyàn.
Nítorí náà, ìwádìí àìdásí lórí onírúurú okùn iṣan egungun nípa lílo àwọn irinṣẹ́ “omics” alágbára jẹ́ pàtàkì ṣùgbọ́n ó tún jẹ́ ìpèníjà, ní apá kan nítorí ìwà multinucleated ti okùn iṣan egungun. Síbẹ̀síbẹ̀, àwọn ìmọ̀-ẹ̀rọ transcriptomics8,9 àti proteomics10 ti ní ìyípadà nínú ìmọ̀lára ní àwọn ọdún àìpẹ́ yìí nítorí onírúurú ìlọsíwájú ìmọ̀-ẹ̀rọ, èyí tí ó fún ni láàyè láti ṣe àyẹ̀wò iṣan egungun ní ìpinnu okùn kan ṣoṣo. Nítorí náà, ìlọsíwájú pàtàkì ni a ti ṣe ní ṣíṣe àfihàn onírúurú okùn kan ṣoṣo àti ìdáhùn wọn sí àwọn ìsúnniṣe atrophic àti ogbó11,12,13,14,15,16,17,18. Ní pàtàkì, àwọn ìlọsíwájú ìmọ̀-ẹ̀rọ wọ̀nyí ní àwọn ohun èlò ìṣègùn, èyí tí ó fún ni àfikún àlàyé àti pípéye nípa àìlera tí ó ní í ṣe pẹ̀lú àrùn. Fún àpẹẹrẹ, pathophysiology ti nemaline myopathy, ọ̀kan lára ​​​​àwọn àrùn iṣan tí a jogún jùlọ (MIM 605355 àti MIM 161800), jẹ́ ohun tí ó díjú àti ìdàrúdàpọ̀.19,20 Nítorí náà, ìṣàfihàn tí ó dára jù ti àìlera àwọn okùn iṣan egungun lè yọrí sí ìlọsíwájú pàtàkì nínú òye wa nípa àrùn yìí.
A ṣe agbekalẹ awọn ọna fun itupalẹ transcriptomic ati proteomic ti awọn okun iṣan egungun kanṣoṣo ti a ya sọtọ lati awọn ayẹwo biopsy eniyan ati lilo wọn si ẹgbẹẹgbẹrun awọn okun, eyiti o fun wa laaye lati ṣe iwadii iyatọ sẹẹli ti awọn okun iṣan egungun eniyan. Ninu iṣẹ yii, a ṣe afihan agbara ti transcriptomic ati proteomic phenotyping ti awọn okun iṣan ati idanimọ awọn amuaradagba ti iṣelọpọ, ribosomal, ati awọn ọlọjẹ idapọ sẹẹli gẹgẹbi awọn orisun pataki ti iyipada interfiber. Pẹlupẹlu, nipa lilo iṣẹ-ṣiṣe proteomic yii, a ṣe afihan iwulo ile-iwosan ti nematode myopathy ninu awọn okun iṣan egungun kan, ti o ṣafihan iyipada ti a ṣeto si awọn okun ti kii ṣe oxidative laisi iru okun ti o da lori MYH.
Láti ṣe ìwádìí lórí ìyàtọ̀ tó wà láàárín àwọn okùn iṣan egungun ènìyàn, a ṣe àgbékalẹ̀ iṣẹ́ méjì láti jẹ́ kí ìwádìí transcriptome àti proteome ti àwọn okùn iṣan egungun kan ṣoṣo (Àwòrán 1A àti Àfikún Àwòrán 1A). A ṣe àgbékalẹ̀ àti ṣe àtúnṣe ọ̀pọ̀lọpọ̀ ìgbésẹ̀ ọ̀nà, láti ibi ìpamọ́ àpẹẹrẹ àti ìpamọ́ RNA àti ìwà títọ́ amuaradagba sí ṣíṣe àtúnṣe throughput fún ọ̀nà kọ̀ọ̀kan. Fún ìwádìí transcriptome, a ṣe àṣeyọrí èyí nípa fífi àwọn barcode molecular pàtó sí ìpele àkọ́kọ́ ti transcription reverse, èyí tí ó jẹ́ kí a kó àwọn okùn 96 jọ fún ìṣiṣẹ́ ìsàlẹ̀ tí ó munadoko. Ìtẹ̀léra jíjinlẹ̀ (±1 mílíọ̀nù ìkàwé fún okùn kan) ní ìfiwéra pẹ̀lú àwọn ọ̀nà sẹ́ẹ̀lì kanṣoṣo ìbílẹ̀ tún mú kí ìwádìí transcriptome sunwọ̀n sí i. 21 Fún proteomics, a lo ìpele chromatographic kukuru (ìṣẹ́jú 21) tí a so pọ̀ mọ́ ìkórajọ data DIA-PASEF lórí spectrometer mass timsTOF láti ṣe àtúnṣe jíjìn proteome nígbàtí a ń pa ìṣiṣẹ́ gíga mọ́. 22,23 Láti ṣe ìwádìí lórí ìyàtọ̀ tó wà láàárín àwọn okùn iṣan egungun tó ní ìlera, a ṣe àfihàn àwọn okùn onípele 1,050 láti ọ̀dọ̀ àwọn okùn onípele 14 tó ní ìlera àti àwọn proteomes ti okùn onípele 1,038 láti ọ̀dọ̀ àwọn okùn onípele 5 tó ní ìlera (Àtẹ Àfikún 1). Nínú ìwé yìí, a pe àwọn okùn onípele 1,000 àti àwọn proteomes ní 1,000. Ọ̀nà wa ṣàwárí àpapọ̀ àwọn okùn onípele 27,237 àti àwọn protein 2,983 nínú àwọn okùn onípele 1,000 (Àwòrán 1A, Àwọn Okùn Onípele 1–2). Lẹ́yìn tí a ti ṣàtúnṣe àwọn okùn onípele 1 àti proteomic fún àwọn jínì tí a rí >1,000 àti àwọn iye tó wúlò 50% fún okùn kọ̀ọ̀kan, a ṣe àwọn okùn onípele 925 àti 974 nínú okùn onípele 1 àti proteomes ní tòtò. Lẹ́yìn ìṣàlẹ̀, a rí ìpíndọ́gba àwọn jínì 4257 ± 1557 àti àwọn prótíìnì 2015 ± 234 (àròpín ± SD) fún okùn kọ̀ọ̀kan, pẹ̀lú ìyàtọ̀ láàárín àwọn ènìyàn díẹ̀ (Àfikún Àwòrán 1B–C, Àwọn Dáta Ìfikún 3–4). Síbẹ̀síbẹ̀, ìyàtọ̀ inú-ọ̀rọ̀ náà hàn gbangba ju gbogbo àwọn olùkópa lọ, ó ṣeéṣe kí ó jẹ́ nítorí ìyàtọ̀ nínú RNA/prótíìnì èrè láàárín àwọn okùn tí ó ní gígùn ọ̀tọ̀ọ̀tọ̀ àti àwọn agbègbè ìkọjá. Fún ọ̀pọ̀lọpọ̀ àwọn prótíìnì (>2000), iye ìyípadà náà wà lábẹ́ 20% (Àwòrán Ìfikún 1D). Àwọn ọ̀nà méjèèjì gbà láàyè láti gba onírúurú àkọsílẹ̀ àti àwọn prótíìnì pẹ̀lú àwọn àmì tí a fihàn gidigidi tí ó ṣe pàtàkì fún ìfàmọ́ra iṣan (fún àpẹẹrẹ, ACTA1, MYH2, MYH7, TNNT1, TNNT3) (Àfikún Àwòrán 1E–F). Pupọ julọ awọn ẹya ara ẹrọ ti a ṣe idanimọ wọpọ laarin awọn data transcriptomic ati proteomic (Afikun Aworan 1G), ati apapọ kikankikan UMI/LFQ ti awọn ẹya ara ẹrọ wọnyi ni ibatan daradara ni deede (r = 0.52) (Afikun Aworan 1H).
Ìṣiṣẹ́ ìṣiṣẹ́ ìkọ̀wé àti proteomics (tí a ṣẹ̀dá pẹ̀lú BioRender.com). Àwọn ìlà BD Dynamic range curves fún MYH7, MYH2, àti MYH1, àti àwọn ààlà ìṣirò fún ìyàsọ́tọ̀ irú okùn. E, F Pínpín ìfihàn MYH kọjá àwọn okùn nínú àwọn ìwádìí ìkọ̀wé àti proteomics. G, H Àwọn ìwádìí ìṣàfihàn àti ìṣàfihàn onírúurú (UMAP) fún àwọn ìkọ̀wé àti proteomics tí a fi àwọ̀ ṣe nípa irú okùn tí ó dá lórí MYH. I, J Àwọn ìwádìí ẹ̀yà tí ó ń fi ìfihàn MYH7, MYH2, àti MYH1 hàn nínú àwọn ìwádìí ìkọ̀wé àti proteomics.
Ní àkọ́kọ́, a pinnu láti fi irú okùn tí ó dá lórí MYH sí okùn kọ̀ọ̀kan nípa lílo ọ̀nà tí a ṣe àtúnṣe tí ó ń lo àǹfààní ìfọkànsí gíga àti ìyípadà ti ìfọ̀rọ̀wérọ̀ MYH nínú àwọn ìwádìí omics. Àwọn ìwádìí tí ó ti kọjá ti lo àwọn ààlà aláìṣeédá láti fi àmì sí okùn gẹ́gẹ́ bí irú 1 mímọ́, irú 2A, irú 2X, tàbí adalu tí ó da lórí ìpín ogorun ìfọ̀rọ̀wérọ̀ tí ó wà ní pàtó ti àwọn oríṣiríṣi MYHs11,14,24. A lo ọ̀nà mìíràn tí a fi ṣe àkójọ ìfọ̀rọ̀wérọ̀ okùn kọ̀ọ̀kan nípasẹ̀ àwọn MYH tí a lò láti tẹ okùn náà: MYH7, MYH2, àti MYH1, tí ó bá irú 1 mu, irú 2A, àti irú 2X, lẹ́sẹẹsẹ. Lẹ́yìn náà, a ṣe ìṣirò ìsàlẹ̀ ojú ìfàsẹ́yìn ti ìlà kọ̀ọ̀kan tí ó yọrí sí, a sì lò ó gẹ́gẹ́ bí ààlà láti fi àwọn okùn sí ipò rere (lókè ààlà) tàbí odi (lábẹ́ ààlà) fún MYH kọ̀ọ̀kan (Àwòrán 1B–D). Àwọn dátà wọ̀nyí fihàn pé MYH7 (Àwòrán 1B) àti MYH2 (Àwòrán 1C) ní àwọn ìpìlẹ̀ ìfọ̀rọ̀wérọ̀ títàn/ìparẹ́ tí ó yàtọ̀ síra ní ìpele RNA ní ìfiwéra pẹ̀lú ìpele amuaradagba. Ní tòótọ́, ní ìpele amuaradagba, àwọn okùn díẹ̀ ni kò ṣe àfihàn MYH7, kò sì sí okùn tí ó ní ìfihàn MYH2 100%. Lẹ́yìn náà, a lo àwọn ààlà ìfihàn tí a ti pinnu tẹ́lẹ̀ láti fi àwọn okùn tí a dá lórí MYH hàn sí gbogbo okùn nínú ìwádìí kọ̀ọ̀kan. Fún àpẹẹrẹ, a yan okùn MYH7+/MYH2-/MYH1- sí oríṣi 1, nígbà tí a yan okùn MYH7-/MYH2+/MYH1+ sí oríṣi 2A/2X tí a dàpọ̀ (wo Àtẹ Àfikún 2 fún àpèjúwe kíkún). Ní ​​pípọ̀ gbogbo okùn, a rí ìpínkiri tó jọra gan-an ti àwọn okùn tí a dá lórí MYH ní ipele RNA (Àwòrán 1E) àti amuaradagba (Àwòrán 1F), nígbà tí ìṣọ̀kan ìbátan ti àwọn okùn tí a dá lórí MYH yàtọ̀ síra láàárín àwọn ènìyàn, gẹ́gẹ́ bí a ti ṣe yẹ (Àwòrán Àfikún 2A). Ọ̀pọ̀lọpọ̀ okùn ni a pín sí oríṣi 1 mímọ́ (34–35%) tàbí oríṣi 2A (36–38%), bó tilẹ̀ jẹ́ pé a tún rí iye pàtàkì ti okùn 2A/2X tí a dàpọ̀ (16–19%). Ìyàtọ̀ pàtàkì kan ni pé a lè rí àwọn okùn irú 2X mímọ́ ní ìpele RNA nìkan, ṣùgbọ́n kìí ṣe ní ìpele amuaradagba, èyí tí ó fihàn pé ìfarahàn MYH kíákíá ni a ti ṣàkóso ní díẹ̀ lẹ́yìn ìkọ̀wé.
A fi idi ilana titẹ okun MYH ti o da lori proteomics mulẹ nipa lilo dot blotting ti o da lori antibody, awọn ọna mejeeji si ṣaṣeyọri 100% ni dida awọn okun iru 1 ati iru 2A mimọ mọ (wo Afikun Aworan 2B). Sibẹsibẹ, ọna ti o da lori proteomics jẹ diẹ sii ni itara, o munadoko diẹ sii ni dida awọn okun adalu mọ, ati wiwọn ipin ti jiini MYH kọọkan ninu okun kọọkan. Awọn data wọnyi fihan imunadoko ti lilo ọna ti o da lori omics ti o ni itara pupọ lati ṣe apejuwe awọn iru okun iṣan egungun.
Lẹ́yìn náà, a lo àpapọ̀ ìwífún tí transcriptomics àti proteomics pèsè láti pín àwọn myofibers ní ìbámu pẹ̀lú transcriptome tàbí proteome wọn pátápátá. Nípa lílo ọ̀nà ìṣàfihàn àti ìṣàfihàn uniform manifold (UMAP) láti dín ìwọ̀n náà kù sí àwọn èròjà pàtàkì mẹ́fà (Àfikún Àwòrán 3A–B), a lè fojú inú wo ìyàtọ̀ myofiber nínú transcriptome (Àwòrán 1G) àti proteome (Àwòrán 1H). Lóòótọ́, àwọn olùkópa kò kó àwọn myofibers jọ (Àfikún Àwòrán 3C–D) tàbí àwọn ọjọ́ ìdánwò (Àfikún Àwòrán 3E) nínú àwọn ìwádìí transcriptomics tàbí proteomics, èyí tí ó fihàn pé ìyàtọ̀ inú-ọ̀rọ̀ nínú àwọn okùn iṣan egungun ga ju ìyàtọ̀ láàrín-ọ̀rọ̀. Nínú ìtàn UMAP, àwọn ẹgbẹ́ méjì tí ó yàtọ̀ tí ó dúró fún àwọn myofibers “yára” àti “lọ́ra” farahàn (Àwòrán 1G–H). A kó àwọn okùn myofiber MYH7+ (díẹ̀) jọ sí òpó rere ti UMAP1, nígbàtí a kó àwọn okùn myofiber MYH2+ àti MYH1+ (díẹ̀) jọ sí òpó odi ti UMAP1 (Àwòrán 1I–J). Síbẹ̀síbẹ̀, a kò ṣe ìyàtọ̀ láàárín àwọn oríṣi okùn tí ó yára-twitch (ìyẹn, irú 2A, irú 2X, tàbí adalu 2A/2X) tí ó dá lórí ìṣàfihàn MYH, èyí tí ó fihàn pé ìṣàfihàn MYH1 (Àwòrán 1I–J) tàbí àwọn àmì myofiber 2X mìíràn bíi ACTN3 tàbí MYLK2 (Àwòrán Àfikún 4A–B) kò ṣe ìyàtọ̀ láàárín àwọn oríṣi okùn myofiber tí ó yàtọ̀ síra nígbà tí a bá ń ronú nípa gbogbo transcriptome tàbí proteome. Jù bẹ́ẹ̀ lọ, ní ìfiwéra pẹ̀lú MYH2 àti MYH7, àwọn ìwé àkọsílẹ̀ tàbí àwọn prótíìnì díẹ̀ ni ó ní ìbáṣepọ̀ rere pẹ̀lú MYH1 (Àwòrán Àfikún 4C–H), èyí tí ó fihàn pé ọ̀pọ̀lọpọ̀ MYH1 kò ṣe àfihàn transcriptome/proteome myofiber ní kíkún. Àwọn ìparí èrò kan náà ni a dé nígbà tí a ń ṣe àyẹ̀wò ìṣàfihàn àpapọ̀ àwọn isoforms MYH mẹ́ta ní ìpele UMAP (Àfikún Àwòrán 4I–J). Nítorí náà, nígbà tí a lè dá àwọn okùn 2X mọ̀ ní ìpele ìkọ̀wé nípa lílo ìwọ̀n MYH nìkan, a kò lè dá àwọn okùn MYH1+ mọ̀ yàtọ̀ sí àwọn okùn kíákíá mìíràn nígbà tí a bá ń ronú nípa gbogbo transcriptome tàbí proteome.
Gẹ́gẹ́ bí ìwádìí àkọ́kọ́ lórí ìyàtọ̀ okùn onípele díẹ̀ ju MYH lọ, a ṣe àyẹ̀wò àwọn protein mẹ́rin tí a ti fìdí múlẹ̀: TPM3, TNNT1, MYL3, àti ATP2A22. Àwọn oríṣiríṣi okùn onípele díẹ̀ fi ìbáṣepọ̀ Pearson pẹ̀lú MYH7 hàn, bó tilẹ̀ jẹ́ pé wọn kò pé, nínú transcriptomics méjèèjì (Àwòrán Àfikún 5A) àti proteomics (Àwòrán Àfikún 5B). Nǹkan bí 25% àti 33% àwọn okùn onípele díẹ̀ ni a kò pín sí oríṣiríṣi okùn onípele díẹ̀ nípa gbogbo oríṣiríṣi okùn onípele/protein nínú transcriptomics (Àwòrán Àfikún 5C) àti proteomics (Àwòrán Àfikún 5D), lẹ́sẹẹsẹ. Nítorí náà, ìpínsísọ̀rí okùn onípele díẹ̀ tí a gbé ka oríṣiríṣi okùn onípele/protein ń mú kí ìṣòro afikún wá, kódà fún àwọn protein tí a mọ̀ pé wọ́n jẹ́ oríṣiríṣi okùn onípele kan. Èyí fihàn pé ìpínsísọ̀rí okùn tí a gbé karí àwọn isoforms ti ìdílé okùn onípele/protein kan lè má ṣe àfihàn ìyàtọ̀ gidi ti okùn onípele egungun.
Láti túbọ̀ ṣe àwárí ìyípadà phenotypic ti awọn okun iṣan egungun eniyan ni iwọn ti gbogbo awoṣe omics, a ṣe idinku iwọn data naa laisi ojusaju nipa lilo itupalẹ apakan pataki (PCA) (Àwòrán 2A). Gẹgẹ bi awọn apẹrẹ UMAP, ko si olukopa tabi ọjọ idanwo ti o ni ipa lori ikojọpọ okun ni ipele PCA (Awọn Àwòrán Afikun 6A–C). Ninu awọn data mejeeji, a ṣalaye iru okun ti o da lori MYH nipasẹ PC2, eyiti o fihan ẹgbẹ ti awọn okun type 1 ti o lọra-slow-twitch ati ẹgbẹ keji ti o ni iru 2A ti o yara-switch, iru 2X, ati awọn okun 2A/2X adalu (Àwòrán 2A). Ninu awọn data mejeeji, awọn ẹgbẹ meji wọnyi ni a so pọ nipasẹ nọmba kekere ti awọn okun type 1/2A adalu. Gẹgẹbi a ti ṣe yẹ, itupalẹ aṣoju ti awọn awakọ PC akọkọ jẹri pe PC2 ni o wakọ nipasẹ awọn ibuwọlu contractile ati ti iṣelọpọ (Àwòrán 2B ati Awọn Àwòrán Afikun 6D–E, Awọn Data Afikun 5–6). Ni gbogbogbo, a rii pe iru okun ti o da lori MYH to lati ṣalaye iyipada ti nlọ lọwọ pẹlu PC2, ayafi awọn okun ti a pe ni 2X ti a pin kaakiri gbogbo transcriptome laarin ẹgbẹ iyara.
A. Àwọn ìpìlẹ̀ àgbéyẹ̀wò pàtàkì (PCA) ti àwọn ìpìlẹ̀ àgbéyẹ̀wò àti proteome tí a fi àwọ̀ ṣe gẹ́gẹ́ bí irú okùn tí a fi ṣe àwọ̀ lórí MYH. B. Ìṣàyẹ̀wò àgbéyẹ̀wò àwọn ìpìlẹ̀ àti àwọn ìpìlẹ̀ amuaradagba nínú PC2 àti PC1. A ṣe ìṣàyẹ̀wò ìṣirò nípa lílo ìpìlẹ̀ àpò ìdìpọ̀Profiler àti àwọn iye p tí a ṣe àtúnṣe Benjamini-Hochberg. C, D. Àwọn ìpìlẹ̀ PCA tí a fi àwọ̀ ṣe gẹ́gẹ́ bí àwọn ọ̀rọ̀ intercellular adhesion gene ontology (GO) nínú àwọn ọ̀rọ̀ transcriptome àti costamere GO nínú proteome. Àwọn ọfà dúró fún ìpìlẹ̀ àti àwọn ìpìlẹ̀ amuaradagba àti àwọn ìtọ́sọ́nà wọn. E, F. Àwọn ìpìlẹ̀ àgbéyẹ̀wò àti projection (UMAP) ti àwọn ìpìlẹ̀ àgbéyẹ̀wò ti àwọn ìpìlẹ̀ àgbéyẹ̀wò tí ó ń fi àwọn ìpele ìfihàn hàn láìsí irú okùn tí ó lọ́ra/yára. G, H. Ìbáṣepọ̀ láàrín àwọn ìpìlẹ̀ PC2 àti PC1 nínú àwọn ìpìlẹ̀ àti àwọn proteomes.
Láìròtẹ́lẹ̀, irú myofiber tí a fi MYH ṣe ṣàlàyé ìpele kejì tí ó ga jùlọ ti ìyàtọ̀ (PC2), èyí tí ó fihàn pé àwọn ohun mìíràn tí ó ní í ṣe pẹ̀lú ìrísí myofiber tí a fi MYH ṣe (PC1) ló ń kó ipa pàtàkì nínú ṣíṣàkóso ìyàtọ̀ okùn iṣan egungun. Ìṣàyẹ̀wò àfikún àwọn awakọ̀ tí ó ga jùlọ nínú PC1 fihàn pé ìyàtọ̀ nínú PC1 ni a pinnu ní pàtàkì nípa ìfaramọ́ sẹ́ẹ̀lì àti akoonu ribosome nínú transcriptome, àti costameres àti ribosomal proteins nínú proteome (Àwòrán 2B àti Àfikún Àwòrán 6D–E, Àfikún Àkójọ Dáta 7). Nínú iṣan egungun, costameres so Z-disiki pọ̀ mọ́ sarcolemma wọ́n sì ní ipa nínú gbigbe agbára àti àmì ìfàmì sí i. 25 Àwọn àwòrán PCA tí a ṣe àkọlé nípa lílo ìfaramọ́ sẹ́ẹ̀lì (transcriptome, Àwòrán 2C) àti costamere (proteome, Àwòrán 2D) fihàn ìyípadà apá òsì tí ó lágbára nínú PC1, tí ó fihàn pé àwọn ẹ̀yà ara wọ̀nyí ní ọ̀pọ̀lọpọ̀ nínú àwọn okùn kan.
Àyẹ̀wò tó ṣe kedere nípa ìṣọ̀pọ̀ myofiber ní ìpele UMAP fi hàn pé ọ̀pọ̀lọpọ̀ àwọn ẹ̀yà ara fi ìpele ìfarahàn MYH tí kò ní ìrísí myofiber hàn dípò ìpele ìṣàpẹẹrẹ myofiber. A ṣe àkíyèsí ìtẹ̀síwájú yìí fún ọ̀pọ̀lọpọ̀ àwọn jínì tí ó ní í ṣe pẹ̀lú àwọn àìsàn (Àwòrán 2E), bíi CHCHD10 (àrùn neuromuscular), SLIT3 (àìlera iṣan), CTDNEP1 (àrùn iṣan). A tún ṣe àkíyèsí ìtẹ̀síwájú yìí jákèjádò proteome, títí kan àwọn prótíìnì tí ó ní í ṣe pẹ̀lú àwọn àrùn ọpọlọ (UGDH), àmì insulin (PHIP), àti ìkọ̀wé (HIST1H2AB) (Àwòrán 2F). Ní ​​àpapọ̀, àwọn dátà wọ̀nyí fi ìtẹ̀síwájú hàn nínú ìyípadà nínú ìyípadà onípele-onírúurú tí kò ní ìrísí okùn lórí àwọn okùn myofibers tó yàtọ̀ síra.
Ó yani lẹ́nu pé àwọn jínì awakọ̀ nínú PC2 fi ìbáṣepọ̀ transcriptome-proteome tó dára hàn (r = 0.663) (Àwòrán 2G), èyí tó fihàn pé àwọn irú okùn onípele díẹ̀díẹ̀ àti kíákíá, àti pàápàá jùlọ àwọn ohun ìní ìfàmọ́ra àti ìṣẹ̀dá ti àwọn okùn onípele egungun, ni a ń ṣàkóso nípasẹ̀ ìkọ̀wé. Síbẹ̀síbẹ̀, àwọn jínì awakọ̀ nínú PC1 kò fi ìbáṣepọ̀ transcriptome-proteome hàn (r = -0.027) (Àwòrán 2H), èyí tó fihàn pé àwọn ìyàtọ̀ tí kò ní í ṣe pẹ̀lú àwọn okùn onípele díẹ̀díẹ̀/kíákíá ni a ń ṣàkóso ní pàtàkì lẹ́yìn ìkọ̀wé. Nítorí pé àwọn ìyàtọ̀ nínú PC1 ni a ṣe àlàyé rẹ̀ ní pàtàkì nípasẹ̀ àwọn ọ̀rọ̀ ontology jínì ribosomal, àti nítorí pé àwọn ribosomes ń kó ipa pàtàkì àti pàtàkì nínú sẹ́ẹ̀lì nípa kíkópa nínú àti níní ipa lórí ìtumọ̀ amuaradagba,31 a tẹ̀síwájú láti ṣe ìwádìí lórí ìyàtọ̀ ribosomal tí a kò retí yìí.
A kọ́kọ́ ya àwòrán ìṣàyẹ̀wò àwọn èròjà pàtàkì proteomics ní ìbámu pẹ̀lú ọ̀pọ̀lọpọ̀ àwọn èròjà tó wà nínú ọ̀rọ̀ GOCC “cytoplasmic ribosome” (Àwòrán 3A). Bó tilẹ̀ jẹ́ pé ọ̀rọ̀ yìí ní ìdàgbàsókè ní apá rere ti PC1, èyí tó yọrí sí ìpele kékeré, àwọn èròjà ribosomal ń darí ìpínyà ní ìhà méjèèjì ti PC1 (Àwòrán 3A). Àwọn èròjà ribosomal tó ní ìdàgbàsókè ní apá odi ti PC1 ní RPL18, RPS18, àti RPS13 nínú (Àwòrán 3B), nígbà tí RPL31, RPL35, àti RPL38 (Àwòrán 3C) ni àwọn ohun tó ń darí pàtàkì ní apá rere ti PC1. Ó yani lẹ́nu pé, RPL38 àti RPS13 ní ìrísí gíga nínú iṣan egungun ní ìfiwéra pẹ̀lú àwọn èròjà mìíràn (Àwòrán Àfikún 7A). Àwọn àmì ìfọwọ́sowọ́pọ̀ ribosomal tó yàtọ̀ síra wọ̀nyí nínú PC1 kò sí nínú ìwé ìtàn (Àwòrán Àfikún 7B), èyí tó ń fi ìlànà lẹ́yìn ìkọ̀wé hàn.
A. Àwòrán àkójọpọ̀ pàtàkì (PCA) tí a fi àwọ̀ ṣe gẹ́gẹ́ bí àwọn ọ̀rọ̀ ontology jínì cytoplasmic ribosomal (GO) kọjá proteome. Àwọn ọfà fi ìtọ́sọ́nà ìyípadà tí protein ń ṣe nínú àkójọpọ̀ PCA hàn. Gígùn ìlà bá àmì àkójọpọ̀ pàtàkì mu fún protein kan. B, C. Àwọn àkójọpọ̀ ẹ̀yà PCA fún RPS13 àti RPL38. D. Ìṣàyẹ̀wò ìṣọ̀pọ̀ ààtò tí kò ní àbójútó ti àwọn protein ribosomal cytoplasmic. E. Àwòrán ìṣètò ti ribosome 80S (PDB: 4V6X) tí ó ń ṣe àfihàn àwọn protein ribosomal pẹ̀lú ọ̀pọ̀lọpọ̀ nínú àwọn okùn iṣan egungun. F. Àwọn protein ribosomal pẹ̀lú onírúurú stoichiometry tí a gbé kalẹ̀ nítòsí ikanni ìjáde mRNA.
Àwọn èrò nípa ìyapa àti ìyapa ribosomal ni a ti dábàá tẹ́lẹ̀, níbi tí wíwà àwọn ìpín ribosomal tó yàtọ̀ síra (ìyapa ribosomal) lè ní ipa taara lórí ìtumọ̀ amuaradagba nínú onírúurú àsopọ ara32 àti sẹ́ẹ̀lì33 nípasẹ̀ ìyípadà àṣàyàn ti àwọn pools34 ìkọ̀wé mRNA pàtó (ìyapa ribosome). Láti dá àwọn ìpín ti àwọn protein ribosomal tí a fihàn pọ̀ nínú àwọn okun iṣan egungun mọ̀, a ṣe ìṣàyẹ̀wò ìṣọ̀kan hierarchical ti àwọn protein ribosomal nínú proteome láìsí àbójútó (Àwòrán 3D, Àfikún Dáta Set 8). Gẹ́gẹ́ bí a ti ṣe yẹ, àwọn protein ribosomal kò kójọpọ̀ nípa irú okun tí ó dá lórí MYH. Síbẹ̀síbẹ̀, a ṣàwárí àwọn ìṣọ̀kan mẹ́ta ti àwọn protein ribosomal; ìṣọ̀kan àkọ́kọ́ (ribosomal_cluster_1) ni a ṣe àkójọpọ̀ pẹ̀lú RPL38 ó sì ní ìfarahàn tí ó pọ̀ sí i nínú àwọn okun pẹ̀lú profaili PC1 rere. Ìṣọ̀kan kejì (ribosomal_cluster_2) ni a ṣe àkójọpọ̀ pẹ̀lú RPS13 ó sì ga sí i nínú àwọn okun pẹ̀lú profaili PC1 odi. Ẹgbẹ́ kẹta (ribosomal_cluster_3) kò fi ìfarahàn ìyàtọ̀ tí a ṣètò hàn nínú àwọn okùn iṣan egungun, a sì lè kà á sí amuaradagba ribosomal iṣan egungun “mojuto”. Àwọn okùn ribosomal 1 àti 2 ní àwọn protein ribosomal tí a ti fihàn tẹ́lẹ̀ pé wọ́n ń ṣe àkóso ìtumọ̀ mìíràn (fún àpẹẹrẹ, RPL10A, RPL38, RPS19, àti RPS25) wọ́n sì ń nípa lórí ìdàgbàsókè iṣẹ́ (fún àpẹẹrẹ, RPL10A, RPL38).34,35,36,37,38 Gẹ́gẹ́ bí àwọn àbájáde PCA, ìṣojú onírúurú tí a rí ti àwọn protein ribosomal wọ̀nyí kọjá àwọn okùn náà tún fi ìtẹ̀síwájú hàn (Àwòrán Àfikún 7C).
Láti fojú inú wo ibi tí àwọn protein ribosomal onírúru wà nínú ribosome, a lo àpẹẹrẹ ìṣètò ti ribosome ènìyàn 80S (Protein Data Bank: 4V6X) (Àwòrán 3E). Lẹ́yìn yíya àwọn protein ribosomal tí ó jẹ́ ti àwọn ẹgbẹ́ ribosomal onírúru sọ́tọ̀, àwọn ipò wọn kò bá ara wọn mu, èyí tí ó fihàn pé ọ̀nà wa kò pèsè ìdàgbàsókè fún àwọn agbègbè/ìpín kan ti ribosome. Ṣùgbọ́n, ó dùn mọ́ni pé, ìpín àwọn protein subunit ńlá nínú ẹgbẹ́ 2 kéré ju ti àwọn ẹgbẹ́ 1 àti 3 lọ (Àwòrán Àfikún 7D). A ṣe àkíyèsí pé àwọn protein pẹ̀lú stoichiometry tí a yí padà nínú àwọn okun iṣan egungun ni a fi sí ojú ilẹ̀ ribosome (Àwòrán 3E), ní ìbámu pẹ̀lú agbára wọn láti bá àwọn èròjà inú ribosome (IRES) lò nínú onírúurú mRNA, nípa bẹ́ẹ̀ ó ń ṣe àkóso ìtúmọ̀ yíyàn. 40, 41 Jù bẹ́ẹ̀ lọ, ọ̀pọ̀lọpọ̀ àwọn protein pẹ̀lú stoichiometry tí a yí padà nínú àwọn okun iṣan egungun wà nítòsí àwọn agbègbè iṣẹ́ bíi mRNA exit tunnel (Àwòrán 3F), èyí tí ó ń ṣe àkóso ìtẹ̀síwájú ìtẹ̀síwájú àti ìdúró àwọn peptide pàtó. 42 Ní àkótán, àwọn ìwádìí wa fihàn pé stoichiometry ti àwọn protein ribosomal iṣan egungun ń fi àìdọ́gba hàn, èyí tí ó ń yọrí sí ìyàtọ̀ láàárín àwọn okùn iṣan egungun.
Lẹ́yìn náà, a bẹ̀rẹ̀ sí í ṣàwárí àwọn ìfọwọ́sowọ́pọ̀ okùn oníyára àti oníyára àti láti ṣe àwárí àwọn ọ̀nà ìṣàkóṣo ìkọ̀wé wọn. Ní fífi àwọn ìṣùpọ̀ okùn oníyára àti oníyára tí UMAP ṣàlàyé nínú àwọn ìwádìí méjì (Àwòrán 1G–H àti 4A–B), àwọn ìṣàyẹ̀wò transcriptomic àti proteomic ṣàwárí àwọn ànímọ́ tó yàtọ̀ síra 1366 àti 804, lẹ́sẹẹsẹ (Àwòrán 4A–B, Àwọn Ìdáhùn Àfikún 9–12). A kíyèsí àwọn ìyàtọ̀ tí a retí nínú àwọn ìfọwọ́sowọ́pọ̀ tó ní í ṣe pẹ̀lú sarcomeres (fún àpẹẹrẹ, tropomyosin àti troponin), ìsopọ̀ ìfàsẹ́yìn-ìfàsẹ́yìn (SERCA isoforms), àti ìṣiṣẹ́ agbára (fún àpẹẹrẹ, ALDOA àti CKB). Jù bẹ́ẹ̀ lọ, àwọn ìkọ̀wé àti àwọn protein tí ń ṣàkóso ubiquitination amuaradagba ni a fi hàn ní onírúurú ọ̀nà nínú àwọn okùn oníyára àti oníyára (fún àpẹẹrẹ, USP54, SH3RF2, USP28, àti USP48) (Àwòrán 4A–B). Jù bẹ́ẹ̀ lọ, jínì amuaradagba oní-ẹranko RP11-451G4.2 (DWORF), èyí tí a ti fihàn tẹ́lẹ̀ pé ó ní ìyàtọ̀ láàárín àwọn oríṣiríṣi okùn iṣan àgùntàn43 tí ó sì ń mú kí iṣẹ́ SERCA pọ̀ sí i nínú iṣan ọkàn44, ni a gbé ga ní pàtàkì nínú àwọn okùn iṣan egungun oní-ẹ̀jẹ̀ (Àwòrán 4A). Bákan náà, ní ìpele okùn kọ̀ọ̀kan, a rí àwọn ìyàtọ̀ pàtàkì nínú àwọn àmì ìfọwọ́sowọ́pọ̀ tí a mọ̀ bíi àwọn isoforms lactate dehydrogenase tí ó níí ṣe pẹ̀lú metabolism (LDHA àti LDHB, Àwòrán 4C àti Àwòrán Àfikún 8A)45,46 àti àwọn àmì ìfọwọ́sowọ́pọ̀ irú okùn tí a kò mọ̀ tẹ́lẹ̀ (bíi IRX3, USP54, USP28, àti DPYSL3) (Àwòrán 4C). Ìdàpọ̀ pàtàkì wà láàárín àwọn àmì ìfọwọ́sowọ́pọ̀ tí a fi ìyàtọ̀ hàn láàrín àwọn ìtòjọpọ̀ transcriptomic àti proteomic (Àwòrán Àfikún 8B), àti ìbáṣepọ̀ ìyípadà ìfọ́pọ̀ tí ó jẹ́ ìpìlẹ̀ tí ó hàn gbangba ti àwọn ẹ̀yà sarcomere (Àwòrán Àfikún 8C). Àkíyèsí ni pé, àwọn ìfọwọ́sowọ́pọ̀ kan (fún àpẹẹrẹ USP28, USP48, GOLGA4, AKAP13) fi ìlànà tó lágbára lẹ́yìn ìkọ̀wé hàn ní ìpele proteomic nìkan, wọ́n sì ní àwọn ìrísí ìṣàfihàn irú okùn tí ó lọ́ra/kíákíá (Àfikún Àwòrán 8C).
Àwọn àwòrán òkè ayọnáyèéfín A àti B tí wọ́n ń fi àwọn ìṣùpọ̀ onípele díẹ̀díẹ̀ àti kíákíá tí a fi àwọn àwòrán ìṣàfihàn àti ìṣàfihàn (UMAP) hàn nínú Àwòrán 1G–H. Àwọn àmì aláwọ̀ dúró fún àwọn àkọsílẹ̀ tàbí àwọn èròjà tí ó yàtọ̀ síra ní FDR < 0.05, àti àwọn àmì dúdú dúró fún àwọn àkọsílẹ̀ tàbí àwọn èròjà tí ó yàtọ̀ síra ní ìyípadà log > 1. A ṣe ìwádìí ìṣirò ọ̀nà méjì nípa lílo ìdánwò DESeq2 Wald pẹ̀lú àwọn ìwọ̀n p tí a ṣe àtúnṣe Benjamini–Hochberg (transcriptomics) tàbí ọ̀nà àwòṣe Limma linear pẹ̀lú ìwádìí Bayesian tí a tẹ̀lé pẹ̀lú ìṣàtúnṣe Benjamini–Hochberg fún àwọn ìfiwéra púpọ̀ (proteomics). C Àwọn àwòrán ìfọwọ́sowọ́pọ̀ ti àwọn jínì tàbí àwọn èròjà protein tí a yàn tí ó yàtọ̀ síra láàrín àwọn okùn tí ó lọ́ra àti kíákíá. D Ìṣàyẹ̀wò ìdàgbàsókè ti àwọn àkọsílẹ̀ àti àwọn èròjà protein tí a ṣe àtúnṣe gidigidi. Àwọn ìwọ̀n tí ó jọra ni a ṣe àtúnṣe nínú àwọn ìwádìí méméjì, àwọn ìwọ̀n transcriptome ni a ṣe àtúnṣe nìkan nínú transcriptome, àti àwọn ìwọ̀n proteome ni a ṣe àtúnṣe nìkan nínú proteome. A ṣe ìwádìí ìṣirò nípa lílo package clusterProfiler pẹ̀lú àwọn ìwọ̀n p tí a ṣe àtúnṣe Benjamini-Hochberg. E. Àwọn okùn ìkọ̀wé pàtó tí a fi SCENIC ṣe àfihàn nípa irú okùn tí a fi SCENIC ṣe àfihàn rẹ̀, èyí tí ó dá lórí àwọn àmì pàtó tí olùṣàkóso tí a rí gbà láti inú SCENIC àti ìfarahàn mRNA láàárín àwọn okùn. F. Ìṣàfihàn àwọn okùn ìkọ̀wé tí a yàn tí a fi hàn ní ìyàtọ̀ láàárín àwọn okùn tí ó lọ́ra àti èyí tí ó yára.
Lẹ́yìn náà, a ṣe àgbéyẹ̀wò àfikún ìṣàfihàn àwọn jínì àti àwọn prótíìnì tí a fi onírúurú hàn (Àwòrán 4D, Àfikún Dátà 13). Ìmúdàgba ọ̀nà fún àwọn ẹ̀yà ara tí ó yàtọ̀ láàrín àwọn ìwádìí méjèèjì fi àwọn ìyàtọ̀ tí a retí hàn, bí i fatty acid β-oxidation àti àwọn ilana ìṣiṣẹ́ ketone (àwọn okùn tí ó lọ́ra), ìfàmọ́ra myofilament/muscle (àwọn okùn tí ó yára àti lọ́ra, lẹ́sẹẹsẹ), àti àwọn ilana catabolic carbohydrate (àwọn okùn tí ó yára). Iṣẹ́ phosphatase amuaradagba Serine/threonine tún ga sí i nínú àwọn okùn tí ó yára, tí àwọn ẹ̀yà ara bíi àwọn subunits tí ó ń ṣe ìlànà àti catalytic phosphatase (PPP3CB, PPP1R3D, àti PPP1R3A) ń darí, èyí tí a mọ̀ pé ó ń ṣe ìṣàkóso ìṣiṣẹ́ glycogen (47) (Àwọn Àfikún 8D–E). Àwọn ọ̀nà mìíràn tí a fi okùn yára ṣe ni àwọn ara ìṣiṣẹ́ (P-) (YTHDF3, TRIM21, LSM2) nínú proteome (Àfikún Àwòrán 8F), tí ó ṣeé ṣe kí ó ní ipa nínú ìṣètò lẹ́yìn ìkọ̀wé (48), àti ìṣiṣẹ́ factor transcription (SREBF1, RXRG, RORA) nínú transcriptome (Àfikún Àwòrán 8G). Àwọn okùn díẹ̀díẹ̀ ní a mú pọ̀ sí i nínú ìṣiṣẹ́ oxidoreductase (BDH1, DCXR, TXN2) (Àfikún Àwòrán 8H), ìdè amide (CPTP, PFDN2, CRYAB) (Àfikún Àwòrán 8I), extracellular matrix (CTSD, ADAMTSL4, LAMC1) (Àfikún Àwòrán 8J), àti ìṣiṣẹ́ receptor-ligand (FNDC5, SPX, NENF) (Àfikún Àwòrán 8K).
Láti ní òye síi nípa ìlànà ìkọ̀wé tí ó wà lábẹ́ àwọn ànímọ́ irú okùn iṣan tí ó lọ́ra/yára, a ṣe ìwádìí ìdàgbàsókè ìkọ̀wé transcription factor nípa lílo SCENIC49 (Àfikún Dáta 14). Ọ̀pọ̀lọpọ̀ àwọn okùn iṣan tí ó wà nínú ìwé transcription ni a ṣe àfikún púpọ̀ láàárín àwọn okùn iṣan tí ó lọ́ra àti tí ó lọ́ra (Àwòrán 4E). Èyí ní àwọn okùn transcription bíi MAFA, èyí tí a ti so mọ́ ìdàgbàsókè okùn iṣan tí ó lọ́ra tẹ́lẹ̀, 50 àti ọ̀pọ̀lọpọ̀ okùn transcription tí kò ní í ṣe pẹ̀lú àwọn ètò jínì pàtó kan tí ó ní okùn iṣan. Lára àwọn wọ̀nyí, PITX1, EGR1, àti MYF6 ni okùn transcription tí ó ní ọrọ̀ jùlọ nínú àwọn okùn iṣan tí ó lọ́ra (Àwòrán 4E). Ní ​​ìyàtọ̀ sí èyí, ZSCAN30 àti EPAS1 (tí a tún mọ̀ sí HIF2A) ni okùn transcription tí ó ní ọrọ̀ jùlọ nínú àwọn okùn iṣan tí ó lọ́ra (Àwòrán 4E). Ní ​​ìbámu pẹ̀lú èyí, a fi MAFA hàn ní àwọn ipele gíga ní agbègbè UMAP tí ó bá àwọn okùn iṣan tí ó lọ́ra mu, nígbà tí EPAS1 ní àpẹẹrẹ ìfihàn òdìkejì (Àwòrán 4F).
Ní àfikún sí àwọn jínì tí a mọ̀ nípa ìṣàkóṣo èròjà protein, ọ̀pọ̀lọpọ̀ àwọn irú RNA tí kìí ṣe ìṣàkóṣo ló wà tí ó lè ní ipa nínú ìṣàkóso ìdàgbàsókè àti àrùn ènìyàn. 51, 52 Nínú àwọn ìṣàkójọpọ̀ ìkọ̀wé, ọ̀pọ̀lọpọ̀ àwọn RNA tí kìí ṣe ìṣàkóṣo ń fi ìṣàkóṣo irú okùn hàn (Àwòrán 5A àti Àfikún Dáta 15), pẹ̀lú LINC01405, èyí tí ó ṣe pàtàkì fún àwọn okùn tí ó lọ́ra tí a sì ròyìn pé ó dínkù nínú iṣan láti ọ̀dọ̀ àwọn aláìsàn tí wọ́n ní mitochondrial myopathy. 53 Ní ìyàtọ̀ sí èyí, RP11-255P5.3, tí ó bá ìṣàkóṣo ìṣàkóṣo èròjà lnc-ERCC5-5 mu (https://lncipedia.org/db/transcript/lnc-ERCC5-5:2) 54, ń fi ìṣàkóṣo irú okùn kíákíá hàn. LINC01405 (https://tinyurl.com/x5k9wj3h) àti RP11-255P5.3 (https://tinyurl.com/29jmzder) fi hàn pé iṣan egungun ní pàtó (Àfikún Àwòrán 9A–B) wọn kò sì ní àwọn jínì tí a mọ̀ tí ó ní ìdènà nínú agbègbè genomic 1 Mb wọn, èyí tí ó fihàn pé wọ́n kó ipa pàtàkì nínú ṣíṣàkóso àwọn irú okùn dípò ṣíṣàkóso àwọn jínì tí ó ní ìdènà tí ó wà nítòsí. Àwọn ìfihàn ìrísí okùn tí ó lọ́ra/yára ti LINC01405 àti RP11-255P5.3, ní ìtẹ̀léra, ni a fi RNAscope jẹ́rìí sí (Àwòrán 5B–C).
A. Àwọn àkọsílẹ̀ RNA tí kò ní ìṣàfihàn ni a ṣe àkóso rẹ̀ ní pàtàkì nínú àwọn okùn iṣan tí ó lọ́ra àti tí ó yára. B. Àwọn àwòrán RNAscope tí ó ṣojú tí ó ń fi irú okùn tí ó lọ́ra àti tí ó yára hàn ti LINC01405 àti RP11-255P5.3, lẹ́sẹẹsẹ. Ìwọ̀n ìwọ̀n = 50 μm. C. Ìwọ̀n ìfihàn RNA tí kò ní ìṣàfihàn irú myofiber pàtó gẹ́gẹ́ bí RNAscope ṣe pinnu (n = biopsies 3 láti ọ̀dọ̀ àwọn ènìyàn aláìdádúró, tí a fi àwọn okùn iṣan tí ó yára àti tí ó lọ́ra wéra láàárín olúkúlùkù). A ṣe ìwádìí ìṣirò nípa lílo ìdánwò t-test ti Akẹ́kọ̀ọ́ oní ìrù méjì. Àwọn àwòrán àpótí fi àárín àti ìpele àkọ́kọ́ àti ìkẹta hàn, pẹ̀lú ìrun wíwú tí ó tọ́ka sí àwọn iye tí ó kéré jùlọ àti tí ó pọ̀ jùlọ. D. Iṣẹ́ ìdámọ̀ amuaradagba microbial De novo (tí a ṣẹ̀dá pẹ̀lú BioRender.com). E. A ṣe àfihàn prótéènì oní-ẹ̀rọ LINC01405_ORF408:17441:17358 ní pàtó nínú àwọn okùn iṣan egungun oní-ẹ̀rọ (n=5 biopsies láti ọ̀dọ̀ àwọn olùkópa aláìdáwọ́dúró, tí a fi àwọn okùn iṣan oní-ẹ̀rọ tí ó yára àti lọ́ra wéra nínú olúkúlùkù olùkópa). A ṣe àgbéyẹ̀wò ìṣirò nípa lílo ọ̀nà àwòṣe Limm linear tí a so pọ̀ mọ́ ọ̀nà Bayesian oní-ẹ̀rọ, lẹ́yìn náà ni a ṣe ọ̀nà Benjamini-Hochberg fún ọ̀pọ̀lọpọ̀ ìfiwéra pẹ̀lú àtúnṣe iye-p. Àwọn àwòrán àpótí fi àwọn quartiles àárín, àkọ́kọ́ àti kẹta hàn, pẹ̀lú irùngbọ̀n tí ó tọ́ka sí àwọn iye tí ó pọ̀jù/kéré jùlọ.
Láìpẹ́ yìí, àwọn ìwádìí ti fihàn pé ọ̀pọ̀lọpọ̀ àwọn ìwé àkọsílẹ̀ tí kìí ṣe ìṣàfihàn kòkòrò ló ń ṣàfihàn àwọn èròjà oníkẹ́míkà tí a kọ sílẹ̀, àwọn kan lára ​​wọn sì ń ṣàkóso iṣẹ́ iṣan. 44, 55 Láti dá àwọn èròjà oníkẹ́míkà tí ó ní irú ìṣàfihàn okùn mọ̀, a wá ìwé àkọsílẹ̀ FASTA wa 1000 nípa lílo fáìlì FASTA àdáni tí ó ní ìtẹ̀lé àwọn ìwé àkọsílẹ̀ tí kìí ṣe ìṣàfihàn kòkòrò (n = 305) tí a rí nínú ìwé àkọsílẹ̀ okùn mọ́kà 1000 (Àwòrán 5D). A dá àwọn èròjà oníkẹ́míkà 197 mọ̀ láti inú ìwé àkọsílẹ̀ 22 ọ̀tọ̀ọ̀tọ̀, 71 nínú wọn ni a ṣe ìlànà ní ìyàtọ̀ láàárín àwọn okùn iṣan oníkẹ́míkà tí ó lọ́ra àti tí ó yára (Àwòrán Àfikún 9C àti Àkójọ Dáta Àfikún 16). Fún LINC01405, a dá àwọn ọjà èròjà oníkẹ́míkà mẹ́ta mọ̀, ọ̀kan nínú wọn fi ìṣàfihàn kòkòrò okun tí ó lọ́ra hàn gẹ́gẹ́ bí ìṣàfihàn rẹ̀ (Àwòrán 5E àti Àwòrán Àfikún 9D). Nítorí náà, a dá LINC01405 mọ̀ gẹ́gẹ́ bí jínì tí ó ń ṣàfihàn èròjà oníkẹ́míkà kan pàtó fún àwọn okùn iṣan oníkẹ́míkà tí ó lọ́ra.
A ṣe agbekalẹ iṣẹ ṣiṣe ti o gbooro fun abuda proteomic ti o tobi ti awọn okun iṣan kọọkan ati awọn olutọsọna ti a mọ ti awọn iyatọ okun ni awọn ipo ilera. A lo iṣẹ ṣiṣe yii lati ni oye bi awọn myopathies nemaline ṣe ni ipa lori iyatọ okun iṣan egungun. Awọn myopathies Nemaline jẹ awọn arun iṣan ti a jogun ti o fa ailera iṣan ati, ninu awọn ọmọde ti o ni ipa, wa pẹlu ọpọlọpọ awọn iṣoro pẹlu ibanujẹ atẹgun, scoliosis, ati gbigbe ẹsẹ ti o lopin. 19,20 Ni deede, ninu awọn myopathies nemaline, awọn iyatọ pathogenic ninu awọn jiini bii actin alpha 1 (ACTA1) yorisi pupọ ti idapọ myofiber okun laiyara, botilẹjẹpe ipa yii jẹ oriṣiriṣi. Iyatọ pataki kan ni troponin T1 nemaline myopathy (TNNT1), eyiti o ni ipa ti awọn okun iyara. Nitorinaa, oye ti o dara julọ ti iyatọ ti o wa labẹ dysregulation okun iṣan egungun ti a ṣe akiyesi ninu awọn myopathies nemaline le ṣe iranlọwọ lati tu ibatan ti o nira laarin awọn aisan wọnyi ati iru myofiber silẹ.
Ní ìfiwéra pẹ̀lú àwọn ìṣàkóso tó ní ìlera (n=3 fún ẹgbẹ́ kọ̀ọ̀kan), àwọn myofibers tí a yà sọ́tọ̀ láti ọ̀dọ̀ àwọn aláìsàn nemaline myopathy tí wọ́n ní àwọn ìyípadà nínú àwọn jínì ACTA1 àti TNNT1 fi àmì ìfàsẹ́yìn myofiber tàbí dystrophy hàn (Àwòrán 6A, Àtẹ Àfikún 3). Èyí gbé àwọn ìpèníjà ìmọ̀-ẹ̀rọ pàtàkì kalẹ̀ fún ìwádìí proteomic nítorí iye tí ó lopin ti àwọn ohun èlò tí ó wà. Láìka èyí sí, a lè rí àwọn prótíìnì 2485 nínú àwọn myofibers egungun 272. Lẹ́yìn ìṣàlẹ̀ fún ó kéré tán àwọn prótíìnì tí a ti ṣe ìṣàyẹ̀wò fún o kere tán 1000 àwọn prótíìnì fún okùn kọ̀ọ̀kan, a fi àwọn okùn 250 ṣe ìwádìí bioinformatics lẹ́yìn náà. Lẹ́yìn ìṣàlẹ̀, a ṣe ìṣàyẹ̀wò 1573 ± 359 àwọn prótíìnì fún okùn kọ̀ọ̀kan (Àwòrán Àfikún 10A, Àwọn Àkójọ Dáta Àfikún 17–18). Lóòótọ́, láìka ìdínkù pàtàkì nínú ìwọ̀n okùn sí, ìjìnlẹ̀ proteome ti àwọn àyẹ̀wò aláìsàn nemaline myopathy dínkù díẹ̀. Jù bẹ́ẹ̀ lọ, ṣíṣe àwọn dátà wọ̀nyí nípa lílo àwọn fáìlì FASTA tiwa (pẹ̀lú àwọn àkọsílẹ̀ tí kò ní ìkọ̀wé) jẹ́ kí a lè dá àwọn prótíìnì microbial márùn-ún mọ̀ nínú àwọn myofibers skeletal láti ọ̀dọ̀ àwọn aláìsàn nemaline myopathy (Àfikún Dátà Set 19). Ìwọ̀n agbára proteome náà gbòòrò gan-an, àti pé gbogbo àwọn prótíìnì nínú ẹgbẹ́ ìṣàkóso bá àwọn àbájáde ìwádìí proteome 1000-fiber tẹ́lẹ̀ mu (Àfikún Àfikún Àfikún 10B–C).
A. Àwọn àwòrán onígun mẹ́ta tí ó ń fi ìfàsẹ́yìn okùn tàbí dystrophy hàn àti bí oríṣiríṣi okùn ṣe pọ̀ tó dá lórí MYH nínú àwọn myopathies ACTA1 àti TNNT1 nemaline (NM). Ààlà ìwọ̀n = 100 μm. Láti rí i dájú pé àwọ̀ ara tún ṣe é ṣe kí ó máa tàn káàkiri àwọn aláìsàn ACTA1 àti TNNT1, a fi àwọ̀ ara hàn àwọn aláìsàn mẹ́ta ní ìgbà méjì sí mẹ́ta (apá mẹ́rin fún ọ̀ràn kọ̀ọ̀kan) kí a tó yan àwọn àwòrán tí ó dúró fún wọn. B. Ìwọ̀n irú okùn nínú àwọn olùkópa tí ó dá lórí MYH. C. Ìwádìí pàtàkì (PCA) ti àwọn okùn iṣan egungun nínú àwọn aláìsàn tí wọ́n ní myopathies àti ìṣàkóso nemaline. D. Àwọn okùn iṣan egungun láti ọ̀dọ̀ àwọn aláìsàn tí wọ́n ní myopathies nemaline àti àwọn ìṣàkóso tí a gbé kalẹ̀ lórí ìpìlẹ̀ PCA tí a pinnu láti inú àwọn okùn 1000 tí a ṣàyẹ̀wò nínú Àwòrán 2. Fún àpẹẹrẹ, àwọn ìpìlẹ̀ okùn ayọnáyèéfín ń fi ìyàtọ̀ láàrín àwọn olùkópa tí wọ́n ní myopathies àti ìṣàkóso ACTA1 àti TNNT1 nemaline, àti láàrín àwọn olùkópa tí wọ́n ní myopathies nemaline ACTA1 àti TNNT1 nemaline. Àwọn yíká aláwọ̀ dúró fún àwọn èròjà protein tí ó yàtọ̀ síra ní π < 0.05, àti àwọn àmì dúdú dúró fún àwọn èròjà protein tí ó yàtọ̀ síra ní FDR < 0.05. A ṣe àgbéyẹ̀wò ìṣirò nípa lílo ọ̀nà àwòṣe Limma linear àti àwọn ọ̀nà Bayesian empirical, lẹ́yìn náà ni a ṣe àtúnṣe iye p fún àwọn ìfiwéra púpọ̀ nípa lílo ọ̀nà Benjamini-Hochberg. H. Ìṣàyẹ̀wò ìdàgbàsókè ti àwọn èròjà protein tí a fihàn ní onírúurú ní gbogbo proteome àti nínú àwọn okùn irú 1 àti 2A. A ṣe àgbéyẹ̀wò ìṣirò nípa lílo package clusterProfiler àti àwọn ìwọ̀n p tí Benjamini-Hochberg ṣe àtúnṣe. I, J. Ìṣàyẹ̀wò ìpín pàtàkì (PCA) àwọn àwòrán tí a fi àwọ̀ extracellular matrix àti àwọn ọ̀rọ̀ mitochondrial gene ontology (GO) ṣe.
Nítorí pé àwọn àrùn nemaline lè nípa lórí ìwọ̀n àwọn àrùn myofiber tí ń yọ MYH jáde nínú iṣan egungun, a kọ́kọ́ ṣe àyẹ̀wò àwọn àrùn myofiber tí ń yọ MYH jáde nínú àwọn aláìsàn tí wọ́n ní àrùn nemaline myopathies àti àwọn ìṣàkóso. A pinnu irú myofiber nípa lílo ọ̀nà tí kò ní ẹ̀tanú tí a ti ṣàlàyé tẹ́lẹ̀ fún àyẹ̀wò myofiber 1000 (Àfikún Àwòrán 10D–E) a sì tún kùnà láti dá àwọn àrùn myofiber 2X mímọ́ mọ̀ (Àwòrán 6B). A ṣe àkíyèsí ipa onírúurú ti àrùn nemaline myopathies lórí irú myofiber, nítorí pé àwọn aláìsàn méjì tí wọ́n ní àwọn ìyípadà ACTA1 ní ìpíndọ́gba myofibers irú 1 tí ó pọ̀ sí i, nígbà tí àwọn aláìsàn méjì tí wọ́n ní àrùn nemaline myopathies TNNT1 ní ìpíndọ́gba myofibers irú 1 tí ó dínkù (Àwòrán 6B). Ní tòótọ́, ìfarahàn MYH2 àti àwọn isoforms troponin kíákíá (TNNC2, TNNI2, àti TNNT3) dínkù nínú àwọn myopathies ACTA1-nemaline, nígbà tí ìfarahàn MYH7 dínkù nínú àwọn myopathies TNNT1-nemaline (Àfikún Àwòrán 11A). Èyí bá àwọn ìròyìn ìṣáájú mu nípa ìyípadà irú myofiber tí ó yàtọ̀ síra nínú àwọn myopathies nemaline.19,20 A fi ìmọ́-ẹ̀rọ-ì ...
Ní ìpele proteome kan ṣoṣo, àwọn okùn iṣan egungun láti ọ̀dọ̀ àwọn aláìsàn ACTA1 àti TNNT1 nemaline myopathy kójọpọ̀ pẹ̀lú ọ̀pọ̀lọpọ̀ okùn ìṣàkóso, pẹ̀lú àwọn okùn myopathy TNNT1 nemaline ni ó sábà máa ń ní ipa tó burú jùlọ (Àwòrán 6C). Èyí hàn gbangba ní pàtàkì nígbà tí a ń ṣe àgbékalẹ̀ àwọn okùn pseudo-inflated (PCA) fún aláìsàn kọ̀ọ̀kan, pẹ̀lú àwọn aláìsàn myopathy TNNT1 nemaline 2 àti 3 tí ó farahàn jùlọ láti inú àwọn àpẹẹrẹ ìṣàkóso (Àwòrán Àfikún 11B, Àfikún Dáta Set 20). Láti lóye bí àwọn okùn láti ọ̀dọ̀ àwọn aláìsàn myopathy ṣe jọra sí àwọn okùn tí ó ní ìlera, a lo ìwífún nípa àwọn okùn tí a rí láti inú àgbékalẹ̀ proteomic ti àwọn okùn 1,000 láti ọ̀dọ̀ àwọn àgbàlagbà tí wọ́n ní ìlera. A ṣe àgbékalẹ̀ àwọn okùn láti inú àkójọ ìwádìí myopathy (ACTA1 àti TNNT1 nemaline myopathy àti àwọn olùṣàkóso) sí orí àkójọ PCA tí a rí láti inú àgbékalẹ̀ proteomic 1000-fiber (Àwòrán 6D). Pínpín àwọn irú okùn MYH pẹ̀lú PC2 nínú àwọn okùn ìṣàkóso jọra sí ìpínkiri okùn tí a rí láti inú ìwádìí proteomic 1000-fiber. Síbẹ̀síbẹ̀, ọ̀pọ̀lọpọ̀ okùn nínú àwọn aláìsàn nemaline myopathy yípadà sí PC2, wọ́n sì jọra pẹ̀lú okùn fast-twitch tó dára, láìka irú okùn MYH tí wọ́n jẹ́. Nítorí náà, bó tilẹ̀ jẹ́ pé àwọn aláìsàn tí wọ́n ní ACTA1 nemaline myopathy fi ìyípadà hàn sí okùn type 1 nígbà tí wọ́n ṣe ìṣírò rẹ̀ nípa lílo àwọn ọ̀nà tí ó dá lórí MYH, àwọn ACTA1 nemaline myopathy àti TNNT1 nemaline myopathy yí proteome iṣan skeletal fiber sí àwọn okùn fast-twitch.
Lẹ́yìn náà, a fi àwọn ẹgbẹ́ aláìsàn kọ̀ọ̀kan wé ara wọn pẹ̀lú àwọn ìṣàkóso tó dára, a sì ṣàwárí àwọn protein 256 àti 552 tí wọ́n ní ìyàtọ̀ nínú àwọn myopathy nemaline ACTA1 àti TNNT1, lẹ́sẹẹsẹ (Àwòrán 6E–G àti Àwòrán Àfikún 11C, Àkójọ Dáta Àfikún 21). Ìwádìí ìdàgbàsókè ìran fi ìdínkù tó ṣọ̀kan hàn nínú àwọn protein mitochondrial (Àwòrán 6H–I, Àkójọ Dáta Àfikún 22). Lọ́nà ìyanu, láìka ìyàtọ̀ tó wà nínú àwọn irú okun nínú myopathies nemaline ACTA1 àti TNNT1, ìdínkù yìí kò dá lórí irú okun tó dá lórí MYH rárá (Àwòrán 6H àti Àkójọ Dáta Àfikún 11D–I, Àkójọ Dáta Àfikún 23). A tún ṣe ìlànà àwọn protein microbial mẹ́ta nínú myopathies ACTA1 tàbí TNNT1 nemaline. Méjì lára ​​àwọn microproteins wọ̀nyí, ENSG00000215483_TR14_ORF67 (tí a tún mọ̀ sí LINC00598 tàbí Lnc-FOXO1) àti ENSG00000229425_TR25_ORF40 (lnc-NRIP1-2), fi ìyàtọ̀ hàn nínú àwọn myofibers irú 1 nìkan. Wọ́n ti ròyìn tẹ́lẹ̀ pé ENSG00000215483_TR14_ORF67 ń kó ipa nínú ìṣètò sẹ́ẹ̀lì. 56 Ní ọwọ́ kejì ẹ̀wẹ̀, ENSG00000232046_TR1_ORF437 (tí ó bá LINC01798 mu) pọ̀ sí i nínú àwọn myofibers irú 1 àti irú 2A nínú ACTA1-nemaline myopathy ní ìfiwéra pẹ̀lú àwọn ìṣàkóso ìlera (Àfikún Àwòrán 12A, Àfikún Dáta Set 24). Ní ìyàtọ̀ sí èyí, àwọn èròjà ribosomal kò ní ipa lórí myopathy nemaline, bó tilẹ̀ jẹ́ pé wọ́n dín RPS17 kù nínú ACTA1 nemaline myopathy (Àwòrán 6E).
Àyẹ̀wò ìdàgbàsókè tún fi hàn pé àwọn ìlànà ètò ìdènà àrùn ara ní ACTA1 àti TNNT1 nemaline myopathies, nígbàtí ìsopọ̀ sẹ́ẹ̀lì tún pọ̀ sí i nínú TNNT1 nemaline myopathy (Àwòrán 6H). Ìdàgbàsókè àwọn ohun tí ó wà nínú ara wọ̀nyí ni a fi hàn nípasẹ̀ àwọn protein matrix extracellular matrix tí ń yí PCA padà nínú PC1 àti PC2 ní ìtọ́sọ́nà odi (ìyẹn ni pé, sí àwọn okùn tí ó ní ipa jùlọ) (Àwòrán 6J). Àwọn ẹgbẹ́ aláìsàn méjèèjì fi ìfarahàn àwọn protein extracellular tí ó ní ipa nínú àwọn ìdáhùn ààbò ara àti àwọn ìlànà àtúnṣe sarcolemmal hàn, bíi annexins (ANXA1, ANXA2, ANXA5)57,58 àti protein wọn tí wọ́n ń ṣe ìbáṣepọ̀ pẹ̀lú S100A1159 (Àfikún Àwòrán 12B–C). A ti ròyìn tẹ́lẹ̀ pé ìlànà yìí ti mú sunwọ̀n síi nínú àwọn dystrophies muscular60 ṣùgbọ́n, gẹ́gẹ́ bí a ti mọ̀, a kò tíì sopọ̀ mọ́ nemaline myopathies tẹ́lẹ̀. Iṣẹ́ déédé ti ẹ̀rọ molikula yìí ni a nílò fún àtúnṣe sarcolemmal lẹ́yìn ìpalára àti fún ìdàpọ̀ àwọn myocytes tuntun tí a ṣẹ̀dá pẹ̀lú myofibers58,61. Nítorí náà, ìṣiṣẹ́ tí ó pọ̀ sí i nínú àwọn ẹgbẹ́ aláìsàn méjèèjì fihàn pé ó jẹ́ àtúnṣe sí ìpalára tí àìdúróṣinṣin myofiber fà.
Àwọn ipa ti nemaline myopathy kọọkan ni a so pọ̀ dáadáa (r = 0.736) wọ́n sì fi ìfarajọra tó yẹ hàn (Àfikún Àwòrán 11A–B), èyí tó fi hàn pé ACTA1 àti TNNT1 nemaline myopathy ní àwọn ipa tó jọra lórí proteome. Síbẹ̀síbẹ̀, a ṣe àkóso àwọn protein kan nínú ACTA1 tàbí TNNT1 nemaline myopathy nìkan (Àfikún Àwòrán 11A àti C). Profibrotic protein MFAP4 jẹ́ ọ̀kan lára ​​àwọn protein tó ga jùlọ nínú TNNT1 nemaline myopathy ṣùgbọ́n kò yí padà nínú ACTA1 nemaline myopathy. SKIC8, ọ̀kan lára ​​​​àwọn PAF1C complex tó ń ṣe àkóso ìkọ̀wé ìran HOX, ni a dínkù nínú TNNT1 nemaline myopathy ṣùgbọ́n kò ní ipa nínú ACTA1 nemaline myopathy (Àfikún Àwòrán 11A). Ìfiwéra taara ti ACTA1 ati TNNT1 nemaline myopathy fi hàn pé àwọn protein mitochondrial dínkù púpọ̀ sí i àti pé àwọn protein ètò àjẹ́mọ́ ara pọ̀ sí i nínú TNNT1 nemaline myopathy (Àwòrán 6G–H àti Àwọn Àwòrán Àfikún 11C àti 11H–I). Àwọn ìwádìí wọ̀nyí bá a mu pẹ̀lú atrophy/dystrophy tó ga jùlọ tí a rí nínú TNNT1 nemaline myopathy ní ìfiwéra pẹ̀lú TNNT1 nemaline myopathy (Àwòrán 6A), èyí tó fi hàn pé TNNT1 nemaline myopathy dúró fún irú àrùn tó le gan-an.
Láti ṣe àyẹ̀wò bóyá àwọn ipa tí a rí nípa myopathy nemaline ń ní ṣì wà ní gbogbo ìpele iṣan, a ṣe àyẹ̀wò proteomic onípele lórí biopsies iṣan láti inú ẹgbẹ́ kan náà ti àwọn aláìsàn TNNT1 nemaline myopathy, a sì fi wọ́n wé àwọn ìṣàkóso (n=3 fún ẹgbẹ́ kan) (Àfikún Àwòrán 13A, Àfikún Àwòrán 25). Gẹ́gẹ́ bí a ti ṣe retí, àwọn ìṣàkóso ní ìbáṣepọ̀ tímọ́tímọ́ nínú àyẹ̀wò àwọn èròjà pàtàkì, nígbà tí àwọn aláìsàn TNNT1 nemaline myopathy fi ìyàtọ̀ tí ó ga jùlọ hàn gẹ́gẹ́ bí èyí tí a rí nínú àyẹ̀wò okùn kan ṣoṣo (Àfikún Àwòrán 13B). Àyẹ̀wò onípele náà ṣe àtúnṣe àwọn èròjà tí a fi onírúurú hàn (Àfikún Àwòrán 13C, Àfikún Àwòrán 26) àti àwọn ìlànà ẹ̀dá alààyè (Àfikún Àwòrán 13D, Àfikún Àwòrán 27) tí a fihàn nípa fífi àwọn okùn kọ̀ọ̀kan wéra, ṣùgbọ́n a pàdánù agbára láti ṣe ìyàtọ̀ láàrín àwọn oríṣi okùn àti pé a kùnà láti ṣàlàyé àwọn ipa àrùn tí ó yàtọ̀ síra lórí àwọn okùn.
Ní àpapọ̀, àwọn ìwádìí wọ̀nyí fihàn pé àwọn proteomics oní-myofiber kan ṣoṣo lè ṣàlàyé àwọn ànímọ́ ìṣègùn tí a kò lè rí nípasẹ̀ àwọn ọ̀nà ìfọkànsí bíi immunoblotting. Jù bẹ́ẹ̀ lọ, àwọn ìwádìí wọ̀nyí tẹnu mọ́ àwọn ààlà ti lílo actin fiber typing (MYH) nìkan láti ṣàpèjúwe àtúnṣe phenotypic. Ní tòótọ́, bó tilẹ̀ jẹ́ pé yíyípadà irú fiber yàtọ̀ láàrín actin àti troponin nemaline myopathies, àwọn méjèjì nemaline myopathies ń dín ìtẹ̀wé MYH láti ìṣiṣẹ́ iṣan skeletal sí proteome iṣan oxidative tí ó yára àti tí kò ní oxidative.
Àìdọ́gba sẹ́ẹ̀lì ṣe pàtàkì fún àwọn àsopọ ara láti lè bá onírúurú ìbéèrè wọn mu. Nínú iṣan ara, èyí sábà máa ń jẹ́ àpèjúwe gẹ́gẹ́ bí irú okùn tí a fi àwọn ìwọ̀n agbára àti àárẹ̀ hàn. Síbẹ̀síbẹ̀, ó ṣe kedere pé èyí ṣàlàyé díẹ̀ lára ​​ìyàtọ̀ okùn iṣan ara, èyí tí ó yàtọ̀ síra, tí ó díjú àti ọ̀pọ̀lọpọ̀ ọ̀nà ju bí a ti rò tẹ́lẹ̀ lọ. Àwọn ìlọsíwájú ìmọ̀ ẹ̀rọ ti tan ìmọ́lẹ̀ sórí àwọn ohun tí ó ń ṣàkóso okùn iṣan ara. Ní tòótọ́, àwọn ìwádìí wa fihàn pé okùn type 2X lè má jẹ́ irú okùn iṣan ara tí ó yàtọ̀. Jù bẹ́ẹ̀ lọ, a ṣàfihàn àwọn protein tí a ti ṣe àgbékalẹ̀, àwọn protein ribosomal àti àwọn protein tí ó ní í ṣe pẹ̀lú sẹ́ẹ̀lì gẹ́gẹ́ bí àwọn ohun tí ó ń pinnu ìyàtọ̀ okùn iṣan ara. Nípa lílo iṣẹ́ proteomic wa sí àwọn àpẹẹrẹ aláìsàn tí wọ́n ní nematode myopathy, a tún fihàn pé ìtẹ̀wé okùn tí a dá lórí MYH kò ṣe àfihàn ìyàtọ̀ okùn iṣan ara ní kíkún, pàápàá jùlọ nígbà tí ètò náà bá dàrú. Ní tòótọ́, láìka irú okùn tí a dá lórí MYH sí, nematode myopathy yọrí sí ìyípadà sí okùn oxidative tí ó yára àti tí kò pọ̀ sí i.
Láti ọ̀rúndún kọkàndínlógún ni a ti pín àwọn okùn iṣan egungun sí ìpín-ẹ̀ka. Àwọn àyẹ̀wò omics tuntun ti jẹ́ kí a bẹ̀rẹ̀ sí ní òye àwọn ìfihàn àwọn oríṣiríṣi okùn MYH àti ìdáhùn wọn sí àwọn ìsúnniṣe tó yàtọ̀ síra. Gẹ́gẹ́ bí a ti ṣàlàyé rẹ̀ níbí, àwọn ọ̀nà omics tún ní àǹfààní ìfàmọ́ra tó ga jù fún ṣíṣàyẹ̀wò àwọn àmì okùn ju àwọn ọ̀nà ìbílẹ̀ tí a fi antibody ṣe, láìgbára lé ìwọ̀n àwọn àmì kan (tàbí díẹ̀) láti ṣàlàyé irú okùn iṣan egungun. A lo àwọn iṣẹ́ ìṣiṣẹ́ transcriptomic àti proteomic tó ṣe àfikún, a sì so àwọn àbájáde pọ̀ láti ṣàyẹ̀wò ìlànà transcriptional àti post-transcriptional ti ìyatọ̀ okùn nínú àwọn okùn iṣan egungun ènìyàn. Ìṣiṣẹ́ yìí yọrí sí àìdámọ̀ àwọn okùn irú 2X mímọ́ ní ìpele amuaradagba nínú vastus lateralis ti ẹgbẹ́ àwọn ọ̀dọ́mọkùnrin wa tó ní ìlera. Èyí bá àwọn ìwádìí okùn kan ṣoṣo tó ti kọjá mu tí ó rí <1% àwọn okùn 2X mímọ́ nínú vastus lateralis tó ní ìlera, bó tilẹ̀ jẹ́ pé ó yẹ kí a fìdí èyí múlẹ̀ nínú àwọn iṣan mìíràn ní ọjọ́ iwájú. Ìyàtọ̀ láàárín wíwá àwọn okùn 2X mímọ́ ní ìpele mRNA àti àwọn okùn 2A/2X adalu nìkan ní ìpele amuaradagba jẹ́ ohun ìyanu. Ìfihàn mRNA isoform MYH kìí ṣe circadian,67 fihàn pé a kò ní “pàdánù” àmì ìbẹ̀rẹ̀ MYH2 nínú àwọn okùn 2X tí ó dàbí pé ó mọ́ ní ìpele RNA. Àlàyé kan tí ó ṣeé ṣe, bó tilẹ̀ jẹ́ pé ó jẹ́ àbájáde lásán, lè jẹ́ ìyàtọ̀ nínú ìdúróṣinṣin prótínì àti/tàbí mRNA láàrín àwọn isoform MYH. Ní tòótọ́, kò sí okùn yára tí ó mọ́ 100% fún èyíkéyìí isoform MYH, kò sì ṣe kedere bóyá àwọn ìpele ìfihàn mRNA MYH1 ní ìpele 70–90% yóò yọrí sí iye MYH1 àti MYH2 tí ó dọ́gba ní ìpele prótínì. Síbẹ̀síbẹ̀, nígbà tí a bá ń ronú nípa gbogbo transcriptome tàbí proteome, ìwádìí àpapọ̀ lè fi ìgboyà dá àwọn ìṣùpọ̀ méjì pàtó tí ó dúró fún àwọn okùn iṣan egungun tí ó lọ́ra àti kíákíá, láìka ìṣètò MYH wọn sí. Èyí bá àwọn ìwádìí mu nípa lílo àwọn ọ̀nà transcriptomic kan ṣoṣo, èyí tí ó sábà máa ń dá àwọn ìṣùpọ̀ myonuclear méjì tí ó yàtọ̀ síra mọ̀. 68, 69, 70 Jù bẹ́ẹ̀ lọ, bó tilẹ̀ jẹ́ pé àwọn ìwádìí proteomic tẹ́lẹ̀ ti ṣàwárí àwọn okùn type 2X, àwọn okùn wọ̀nyìí kò kóra jọ sí ara wọn láti ara àwọn okùn fáárà tó kù, wọ́n sì fi àwọn èròjà díẹ̀ tó pọ̀ ní ìyàtọ̀ hàn ní ìfiwéra pẹ̀lú àwọn okùn fáárà mìíràn tó dá lórí MYH. 14 Àwọn àbájáde wọ̀nyí dámọ̀ràn pé a gbọ́dọ̀ padà sí ojú ìwòye ìbẹ̀rẹ̀ ọ̀rúndún 20 nípa ìpínsísọ̀rí okùn fáárà, èyí tó pín àwọn okùn fáárà egungun ènìyàn sí àwọn ìpele mẹ́ta tó yàtọ̀ síra tó dá lórí MYH, ṣùgbọ́n sí àwọn ìṣùpọ̀ méjì tó dá lórí àwọn ànímọ́ ìṣiṣẹ́ ara àti ìdènà wọn. 63
Èyí tó ṣe pàtàkì jùlọ ni pé, ó yẹ kí a gbé ìṣọ̀kan myofiber yẹ̀ wò ní oríṣiríṣi ìpele. Àwọn ìwádìí “omics” tẹ́lẹ̀ ti tọ́ka sí ọ̀nà yìí, wọ́n fihàn pé àwọn okùn iṣan egungun kò ní àwọn ìṣùpọ̀ onípele ṣùgbọ́n wọ́n wà ní ìtòlẹ́sẹẹsẹ kan. 11, 13, 14, 64, 71 Níbí, a fihàn pé, ní àfikún sí àwọn ìyàtọ̀ nínú àwọn ohun-ìní ìfàsẹ́yìn àti ìṣẹ̀dá ti iṣan egungun, a lè ya àwọn okùn myofibers sọ́tọ̀ nípa àwọn ànímọ́ tó níí ṣe pẹ̀lú ìbáṣepọ̀ sẹ́ẹ̀lì sẹ́ẹ̀lì àti àwọn ọ̀nà ìtúmọ̀. Ní tòótọ́, a rí ìṣọ̀kan ribosome nínú àwọn okùn iṣan egungun tí ó ń ṣe àfikún sí ìṣọ̀kan láìsí àwọn okùn tí ó lọ́ra àti kíákíá. Ohun tó fa ìṣọ̀kan myofiber yìí, láìsí irú okùn tí ó lọ́ra àti kíákíá, kò tíì yé wa, ṣùgbọ́n ó lè tọ́ka sí ìṣètò ààyè pàtàkì láàrín àwọn okùn iṣan tí ó ń dáhùn sí àwọn agbára àti ẹrù pàtó, 72 ìbánisọ̀rọ̀ cellular tàbí organ-specific pẹ̀lú àwọn irú sẹ́ẹ̀lì mìíràn nínú àyíká iṣan 73,74,75 tàbí àwọn ìyàtọ̀ nínú ìṣiṣẹ́ ribosome láàrín àwọn okùn myofibers kọ̀ọ̀kan. Ní tòótọ́, a ti fihàn pé ribosomal heteroplasmy, yálà nípasẹ̀ ìyípadà paralogous ti RPL3 àti RPL3L tàbí ní ìpele 2′O-methylation ti rRNA, ní ìbáṣepọ̀ pẹ̀lú hypertrophy iṣan egungun76,77. Àwọn ìlò onípele-omic àti ààyè tí a so pọ̀ mọ́ ìṣe iṣẹ́ ti àwọn myofibers kọ̀ọ̀kan yóò mú kí òye wa nípa ìṣẹ̀dá iṣan pọ̀ sí i ní ìpele multi-omic78.
Nípa ṣíṣàyẹ̀wò àwọn proteomes ti àwọn myofibers kan ṣoṣo láti ọ̀dọ̀ àwọn aláìsàn tí wọ́n ní nemaline myopathies, a tún fi àǹfààní, ìṣedéédé, àti ìlò ti àwọn proteomics myofiber kan ṣoṣo hàn láti ṣàlàyé pathophysiology ti ìṣàn egungun. Jù bẹ́ẹ̀ lọ, nípa fífi ìṣiṣẹ́ wa wéra pẹ̀lú ìṣàyẹ̀wò proteomics kárí ayé, a lè fi hàn pé àwọn proteomics myofiber kan ṣoṣo ń fúnni ní ìjìnlẹ̀ ìwífún kan náà gẹ́gẹ́ bí àwọn proteomics àsopọ àgbáyé àti fífún ìjìnlẹ̀ yìí gbòòrò nípa ṣíṣàyẹ̀wò àìdọ́gba interfiber àti irú myofiber. Ní àfikún sí àwọn ìyàtọ̀ tí a retí (bó tilẹ̀ jẹ́ pé ó yàtọ̀) nínú ìpíndọ́gba irú okun tí a ṣe àkíyèsí nínú àwọn myopathies nemaline ACTA1 àti TNNT1 ní ìfiwéra pẹ̀lú àwọn ìṣàkóso tí ó ní ìlera,19 a tún kíyèsí àtúnṣe oxidative àti extracellular láìsí ìyípadà irú okun tí MYH ṣe. A ti royin Fibrosis tẹlẹ ninu awọn myopathies TNNT1 nemaline.19 Sibẹsibẹ, itupalẹ wa da lori wiwa yii nipa ṣiṣafihan awọn ipele ti o pọ si ti awọn amuaradagba ti o ni ibatan si wahala ti o jade lati inu awọn sẹẹli, gẹgẹbi awọn annexins, ti o ni ipa ninu awọn ilana atunṣe sarcolemmal, ninu awọn myofibers lati ọdọ awọn alaisan ti o ni awọn myopathies ACTA1 ati TNNT1 nemaline.57,58,59 Ni ipari, ilosoke awọn ipele annexin ninu awọn myofibers lati ọdọ awọn alaisan ti o ni nemaline myopathy le ṣe aṣoju idahun sẹẹli si atunṣe awọn myofibers atrophic ti o nira.
Bó tilẹ̀ jẹ́ pé ìwádìí yìí dúró fún ìwádìí onípele-okun kan ṣoṣo tó tóbi jùlọ nípa àwọn ènìyàn títí di òní, kò sí ní ààlà. A ya àwọn okùn iṣan egungun sọ́tọ̀ láti inú àpẹẹrẹ àwọn olùkópa tí ó kéré àti tí ó jọra àti iṣan kan ṣoṣo (vastus lateralis). Nítorí náà, kò ṣeé ṣe láti yọ àwọn okùn kan pàtó kúrò nínú àwọn irú iṣan àti ní ìpele ti ìṣiṣẹ́ iṣan. Fún àpẹẹrẹ, a kò le yọ ìṣeéṣe ti àwọn okùn ultrafast kan (fún àpẹẹrẹ, okùn 2X mímọ́) tí ó ń yọ jáde nínú àwọn asáré tí a ti kọ́ dáadáa àti/tàbí àwọn asáré agbára79 tàbí nígbà tí iṣan kò bá ṣiṣẹ́ dáadáa66,80. Jù bẹ́ẹ̀ lọ, ìwọ̀n àpẹẹrẹ díẹ̀ ti àwọn olùkópa dí wa lọ́wọ́ láti ṣe ìwádìí lórí ìyàtọ̀ ìbálòpọ̀ nínú àìdọ́gba okùn, nítorí pé a mọ̀ pé àwọn ìpíndọ́gba irú okùn yàtọ̀ láàrín àwọn ọkùnrin àti obìnrin. Jù bẹ́ẹ̀ lọ, a kò lè ṣe ìwádìí transcriptomic àti proteomic lórí àwọn okùn iṣan kan náà tàbí àwọn àpẹẹrẹ láti ọ̀dọ̀ àwọn olùkópa kan náà. Bí àwa àti àwọn ẹlòmíràn ṣe ń tẹ̀síwájú láti mú kí ìwádìí sẹ́ẹ̀lì kan àti sẹ́ẹ̀lì kan ṣoṣo ṣe àtúnṣe nípa lílo ìwádìí omics láti ṣàṣeyọrí àyẹ̀wò tó kéré gan-an (gẹ́gẹ́ bí a ṣe fihàn níbí nínú ìwádìí àwọn okùn láti ọ̀dọ̀ àwọn aláìsàn tí wọ́n ní mitochondrial myopathy), àǹfààní láti so àwọn ọ̀nà multi-omics (àti functional) pọ̀ láàrín àwọn okùn iṣan kan ṣoṣo di ohun tó hàn gbangba.
Ni gbogbogbo, data wa n ṣe idanimọ ati ṣalaye awọn ohun ti o n fa iyatọ ninu iṣan egungun ati lẹhin-gbigba. Ni pataki, a n gbe data kalẹ ti o n koju ẹkọ ti o ti pẹ ninu ẹkọ nipa iṣan egungun ti o ni nkan ṣe pẹlu itumọ ti awọn iru okun ti o da lori MYH. A nireti lati tun ariyanjiyan naa ṣe ati nikẹhin lati tun ronu nipa oye wa nipa ipinya okun iṣan egungun ati iyatọ.
Àwọn olùkópa mẹ́rìnlá ní Caucasian (ọkùnrin méjìlá àti obìnrin méjì) gbà láti kópa nínú ìwádìí yìí. Ìgbìmọ̀ Ìwà rere ti Ilé Ìwòsàn Ghent University (BC-10237) fọwọ́ sí ìwádìí náà, wọ́n tẹ̀lé Ìkéde Helsinki ti ọdún 2013, wọ́n sì forúkọ sílẹ̀ ní ClinicalTrials.gov (NCT05131555). Àwọn ànímọ́ gbogbogbòò ti àwọn olùkópa ni a gbé kalẹ̀ nínú Àtẹ Àfikún 1. Lẹ́yìn gbígba ìfọwọ́sowọ́pọ̀ ọ̀rọ̀ ẹnu àti ìkọ̀wé, àwọn olùkópa ṣe àyẹ̀wò ìṣègùn kí wọ́n tó fi sínú ìwádìí náà. Àwọn olùkópa jẹ́ ọ̀dọ́ (ọdún 22–42), àwọn tí ara wọn le (kò sí àìsàn, kò sí ìtàn sìgá mímu), àti àwọn tí ara wọn le ṣiṣẹ́ dáadáa. A pinnu ìwọ̀n atẹ́gùn tó pọ̀ jùlọ nípa lílo ergometer ìgbésẹ̀ láti ṣe àyẹ̀wò ìlera ara gẹ́gẹ́ bí a ti ṣàlàyé rẹ̀ tẹ́lẹ̀. 81
A gba awọn ayẹwo ayẹwo iṣan ni isinmi ati ni ipo aawẹ ni igba mẹta, ni ọjọ mẹrinla lọtọ. Nitori pe a gba awọn ayẹwo wọnyi gẹgẹbi apakan ti iwadi nla kan, awọn olukopa mu placebo (lactose), alatako olugba H1 (540 mg fexofenadine), tabi alatako olugba H2 (40 mg famotidine) ni iṣẹju 40 ṣaaju ayẹwo naa. A ti fihan tẹlẹ pe awọn alatako olugbagba histamine wọnyi ko ni ipa lori amọdaju iṣan egungun isinmi81, ati pe ko si akojọpọ ti o ni ibatan si ipinlẹ ni awọn eto iṣakoso didara wa (Awọn Afikun Awọn Apẹẹrẹ 3 ati 6). Ounjẹ ti a ṣe deede (41.4 kcal/kg iwuwo ara, carbohydrate iwuwo ara 5.1 g/kg, amuaradagba iwuwo ara 1.4 g/kg, ati ọra iwuwo ara 1.6 g/kg) ni a tọju fun wakati 48 ṣaaju ọjọ idanwo kọọkan, ati pe a jẹ ounjẹ aarọ ti a ṣe deede (1.5 g/kg iwuwo ara carbohydrate) ni owurọ ọjọ idanwo naa. Lábẹ́ anesthesia àdúgbò (0.5 milimita 1% lidocaine láìsí epinephrine), a gba biopsies iṣan láti inú iṣan vastus lateralis nípa lílo percutaneous Bergström aspiration.82 A fi àwọn àpẹẹrẹ iṣan sínú RNA lẹ́sẹ̀kẹsẹ̀ lẹ́yìn náà a sì tọ́jú wọn sí 4°C títí di ìgbà tí a fi fi okùn ọwọ́ gé wọn kúrò (tó ọjọ́ mẹ́ta).
A gbé àwọn ìdìpọ̀ myofiber tuntun tí a yà sọ́tọ̀ sí ibi ìtọ́jú RNAlater tuntun nínú àwo ìbílẹ̀ kan. Lẹ́yìn náà, a fi ọwọ́ ya àwọn myofiber kọ̀ọ̀kan nípa lílo stereomicroscope àti àwọn tweezers tó dára. A yọ okùn mẹ́ẹ̀ẹ́dọ́gbọ̀n kúrò nínú biopsy kọ̀ọ̀kan, a sì ṣe àkíyèsí pàtàkì sí yíyan àwọn okùn láti oríṣiríṣi agbègbè biopsy náà. Lẹ́yìn yíyọ okùn kọ̀ọ̀kan, a fi pẹ̀lẹ́pẹ̀lẹ́ tẹ 3 μl ti lysis buffer (SingleShot Cell Lysis Kit, Bio-Rad) tí ó ní proteinase K àti DNase enzymes láti yọ àwọn protein àti DNA tí a kò fẹ́ kúrò. Lẹ́yìn náà, a bẹ̀rẹ̀ lysis cell àti yíyọ protein/DNA kúrò nípa lílo vortex fún ìgbà díẹ̀, yíyí omi náà padà sínú microcentrifuge, a sì fi incubation sínú iwọ̀n otútù yàrá (10 min). Lẹ́yìn náà, a fi lysate náà sínú thermal cycler (T100, Bio-Rad) ní 37°C fún ìṣẹ́jú 5, 75°C fún ìṣẹ́jú 5, lẹ́yìn náà a tọ́jú rẹ̀ lẹ́sẹ̀kẹsẹ̀ ní -80°C títí a ó fi tún ṣe é.
A ṣe àwọn ìkàwé RNA polyadenylated tí ó bá Illumina mu láti inú 2 µl ti myofiber lysate nípa lílo QuantSeq-Pool 3′ mRNA-Seq Library Prep Kit (Lexogen). Àwọn ọ̀nà tí a lè rí ní kíkún ni a lè rí nínú ìwé ìtọ́ni olùpèsè. Ìlànà náà bẹ̀rẹ̀ pẹ̀lú ìṣètò cDNA àkọ́kọ́ nípasẹ̀ ìkọ̀wé àtúnṣe, nígbà tí a ń ṣe àgbékalẹ̀ àwọn àmì ìdámọ̀ molecule (UMIs) àti àwọn àmì ìṣàpẹẹrẹ i1 pàtó láti rí i dájú pé àwọn àpẹẹrẹ pọ̀ sí i àti láti dín ìyàtọ̀ ìmọ̀-ẹ̀rọ kù nígbà ìṣiṣẹ́ ìsàlẹ̀. Lẹ́yìn náà, a ó kó cDNA láti inú myofibers 96 jọ, a ó sì sọ wọ́n di mímọ́ pẹ̀lú àwọn ìlẹ̀kẹ̀ magnetic, lẹ́yìn náà a ó yọ RNA kúrò, a ó sì ṣe ìṣètò ìpele kejì nípa lílo àwọn primers láìròtẹ́lẹ̀. A ó fi àwọn ìlẹ̀kẹ̀ magnetic wẹ ilé ìkàwé náà mọ́, a ó fi àwọn àmì i5/i7 pàtó sí i nínú pool, a ó sì mú PCR pọ̀ sí i. Ìgbésẹ̀ ìwẹ̀nùmọ́ ìkẹyìn mú àwọn ìkàwé tí ó bá Illumina mu jáde. A ṣe àyẹ̀wò dídára ìlẹ̀kẹ̀ kọ̀ọ̀kan nípa lílo High Sensitivity Small Fragment DNA Analysis Kit (Agilent Technologies, DNF-477-0500).
Ní ìbámu pẹ̀lú ìwọ̀n Qubit, a tún kó àwọn adágún jọ sí i ní ìwọ̀n equimolar (2 nM). Lẹ́yìn náà, a ṣe ìtòlẹ́sẹẹsẹ adágún tí ó jáde lórí ohun èlò NovaSeq 6000 ní ipò boṣewa nípa lílo NovaSeq S2 Reagent Kit (1 × 100 nucleotides) pẹ̀lú 2 nM loading (4% PhiX).
Póìpù wa da lori opo gigun data ti Lexogen's QuantSeq Pool (https://github.com/Lexogen-Tools/quantseqpool_analysis). A kọkọ yọ data kuro pẹlu bcl2fastq2 (v2.20.0) da lori atọka i7/i5. A lẹhinna yọ Read 2 kuro pẹlu idemux (v0.1.6) da lori koodu barcode apẹẹrẹ i1 ati pe a yọ awọn lẹsẹsẹ UMI kuro pẹlu umi_tools (v1.0.1). Lẹhinna a ge awọn kika pẹlu cutadapt (v3.4) ni awọn iyipo pupọ lati yọ awọn kika kukuru kuro (<20 ni gigun) tabi awọn kika ti o jẹ ti awọn lẹsẹsẹ adapter nikan. Lẹhinna a ṣe deede awọn kika si jiini eniyan nipa lilo STAR (v2.6.0c) ati awọn faili BAM ni a ṣe atọka pẹlu SAMtools (v1.11). A yọ awọn kika ti o jọra kuro nipa lilo umi_tools (v1.0.1). Níkẹyìn, a ṣe kika tito lẹtọ nipa lilo featureCounts ninu Subread (v2.0.3). A ṣe iṣakoso didara ni lilo FastQC (v0.11.9) ni awọn ipele agbedemeji pupọ ti opo gigun epo.
Gbogbo ilana bioinformatics ati wiwo siwaju ni a ṣe ni R (v4.2.3), ni pataki nipa lilo iṣẹ Seurat (v4.4.0). 83 Nitorinaa, awọn iye UMI kọọkan ati awọn matrices metadata ni a yipada si awọn ohun Seurat. Awọn jiini ti a fihan ni kere si 30% ti gbogbo awọn okun ni a yọ kuro. Awọn ayẹwo ti ko ni didara ni a yọ kuro ni ibamu si opin o kere ju ti awọn iye UMI 1000 ati awọn jiini ti a rii 1000. Nikẹhin, awọn okun 925 kọja gbogbo awọn igbesẹ sisẹ iṣakoso didara. Awọn iye UMI ni a ṣe deede nipa lilo ọna Seurat SCTransform v2, 84 pẹlu gbogbo awọn ẹya 7418 ti a rii, ati awọn iyatọ laarin awọn olukopa ni a yi pada kuro. Gbogbo awọn metadata ti o yẹ ni a le rii ni Afikun Data 28.